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菌落總數(shù)的檢測方法

發(fā)布時間:2022-03-21人氣:25


一、菌落總數(shù)介紹:

  菌落是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長繁殖而形成的能被肉眼識別的生長物,它是由數(shù)以萬計相同的細(xì)菌集合而成。當(dāng)樣品被稀釋到一定程度,與培養(yǎng)基混合,在一定培養(yǎng)條件下,每個能夠生長繁殖的細(xì)菌細(xì)胞都可以在平板上形成一個可見的菌落。

  菌落總數(shù)就是指在一定條件下(如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等)每克(每毫升)檢樣所生長出來的細(xì)菌菌落總數(shù)。按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定,即在需氧情況下,37℃培養(yǎng)48h,能在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的細(xì)菌菌落總數(shù),所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌,由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求,故難以繁殖生長。因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細(xì)菌總數(shù),菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類,所以有時被稱為雜菌數(shù),需氧菌數(shù)等。

  菌落總數(shù)測定是用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量,它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求,以便對被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。

二、檢驗方法

  菌落總數(shù)的測定,一般將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液,然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合,在一定溫度下,培養(yǎng)一定時間后(一般為48小時),記錄每個平皿中形成的菌落數(shù)量,依據(jù)稀釋倍數(shù),計算出每克(或每ml)原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)。

  基本操作一般包括:樣品的稀釋--傾注平皿--培養(yǎng)48小時--計數(shù)報告。

  國內(nèi)外菌落總數(shù)測定方法基本一致,從檢樣處理、稀釋、傾注平皿到計數(shù)報告無何明顯不同,只是在某些具體要求方面稍有差別,如有的國家在樣品稀釋和傾注培養(yǎng)進(jìn),對吸管內(nèi)液體的流速,稀釋液的振蕩幅度、時間和次數(shù)以及放置時間等均作了比較具體的規(guī)定。

  檢驗方法參見:
  GB4789.2-94 《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》
  SN0168-92 《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品菌落計數(shù)》

三、說明

(一)樣品的處理和稀釋:

  1.操作方法:以無菌操作取檢樣25g(或25ml),放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振要或研磨制成110的均勻稀釋液。

  固體檢樣在加入稀釋液后,最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min,制成110的均勻稀釋液。

  用1ml滅菌吸管吸取110稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管混合均勻,制成1100的稀釋液。

  另取1ml滅菌吸管,按上項操作順序,制10倍遞增稀釋液,如此每遞增稀釋一次即換用11ml滅菌吸管。

  2.無菌操作:操作中必須有無菌操作的概念,所用玻璃器皿必須是完全滅菌的,不得殘留有細(xì)菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝,應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。

  操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘,每個平板不得超過15個菌落。

  3.采樣的代表性:如系固體樣品,取樣時不應(yīng)集中一點,宜多采幾個部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨,液體樣品須經(jīng)過振搖,以獲得均勻稀釋液。

  4.樣品稀釋誤差:為減少樣品稀釋誤差,在連續(xù)遞次稀釋時,每一稀釋液應(yīng)充分振搖,使其均勻,同時每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管。

  在進(jìn)行連續(xù)稀釋時,應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿管壁流入,勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi),以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。

  為減少稀釋誤差,SN標(biāo)準(zhǔn)采用取10mL稀釋液,注入90mL緩沖液中。

  5.稀釋液:樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水,有的采用磷酸鹽緩沖液(或0.1%蛋白胨水),后者對食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對含鹽量較高的食品(如醬油)進(jìn)行稀釋,可以采用滅菌蒸餾水。

(二)傾注培養(yǎng)

  1.操作方法:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計,選擇2~3個適宜稀釋度,分別在制10倍遞增稀釋的同時,以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中,每個稀釋度做兩個平皿。

  將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml,并轉(zhuǎn)動平皿,混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。

  待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平板,置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h,取出計算平板內(nèi)菌落數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),即得每克(每毫升)樣品所含菌落總數(shù)。

  2.傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫,溫度過高會影響細(xì)菌生長,過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴,應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。

  傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一,從12~20ml不等,一般以15ml較為適宜,平板過厚可影響觀察,太薄又易于干裂。傾注時,培基底部如有沉淀物,應(yīng)將底部棄去,以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。

  3.為使菌落能在平板上均勻分布,檢液加入平皿后,應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻,可正反兩個方向旋轉(zhuǎn),檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min,以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。。

  4.培養(yǎng)溫度一般為37℃(水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度,由于其生活環(huán)境水溫較低,故多采用30℃)。培養(yǎng)時間一般為48h,有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度,瓊脂平板培養(yǎng)48h后,培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15%。

  5.為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆,不易分辨,可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板,不經(jīng)培養(yǎng),而于4℃環(huán)境中放置,以便計數(shù)時作對照觀察。

  在某些場合,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培養(yǎng)后菌落呈紅色,易于分別。

(三)計數(shù)和報告

  1.操作方法:培養(yǎng)到時間后,計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)??捎萌庋塾^察,必要時用放大鏡檢查,以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后,求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù),計算處原始樣品中每克(或每ml)中的菌落數(shù),進(jìn)行報告。

  2.到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時間,應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù),應(yīng)將平板放置于04℃,但不得超過24h

  3.計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板(SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25~250個菌落),若有二個稀釋度均在30~300之間時,按國家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定,比值小于或等于2取平均數(shù),比值大于2則其較小數(shù)字(有的規(guī)定不考慮其比值大小,均以平均數(shù)報告)。

  4.若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300,則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如均小于30,則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)有的大于300,有的又小于30,但均不在30~300之間,則應(yīng)以最接近30030的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如所有稀釋度均無菌落生長,則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計算出的菌落數(shù)按估算值報告。

  5.不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比(同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近),即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少,稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象,則應(yīng)視為檢驗中的差錯(有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象,如酸性飲料等),不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。

  6.當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時,如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限,則應(yīng)作為一個菌落計,如存在有幾條不同來源的鏈,則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算,不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長,該平板一般不宜采用,如片狀菌落不到平板一半,而另一半又分布均勻,則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。

  7.當(dāng)計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多(即所有稀釋度均大于300時),但分布很均勻,可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。

  8.菌落數(shù)的報告,按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1~100時,按實有數(shù)字報告,如大于100時,則報告前面兩位有效數(shù)字,第三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克(g)為單位報告,液體檢樣以毫升(ml)為單位報告,表面涂擦則以平方厘米(cm2)報告。

 


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